Quy trình nuôi cấy huyền phù tế bào Gừng Đen, trích xuất hợp chất thứ cấp 5,7 – Dimethoxy Flavone

THÔNG TIN CHUNG

Tên quy trình: Quy trình nuôi cấy huyền phù tế bào Gừng Đen, trích xuất hợp chất thứ cấp 5,7 – Dimethoxy Flavone.

Xuất xứ quy trình: là kết quả nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào gừng đen, trích xuất hợp chất thứ cấp 5,7 – Dimethoxy Flavone phục vụ sản xuất sản phẩm KD 01 – saman ứng dụng cho người rối loạn cương dương”. Mã số đề tài E21-001YHBĐVN.

Đơn vị thực hiện: Viện Y học Bản địa Việt Nam.

Chủ nhiệm đề tài: KS. Hoàng Văn Nam.

Nơi thực hiện: Phòng thí nghiệm Viện Y học Bản địa Việt Nam.

Phạm vi áp dụng: Các công ty công nghệ sinh học; các viện và trung tâm nuôi cấy mô.

Nhóm tác giả: BS.Hoàng Sầm; BS.TS cao cấp Ngô Quang Trúc; CN. Nguyễn Văn Tuấn; DS. Nguyễn Thu Trang; CN. Nguyễn Thục Quyên.

Ưu và nhược điểm của phương pháp:

          - Ưu điểm: Sản xuất ở quy mô công nghiệp; Kiểm soát được các yếu tố gây độc hại; không phụ thuộc vào tự nhiên; Giá thành cạnh tranh.

          - Nhược điểm: Chi phí ban đầu cao; Thao tác phức tạp, khó thực hiện; lao động có trình độ cao.

2. Thuyết minh quy trình

2.1 Củ Gừng đen

  • Chọn củ đã già, không bị nhiễm bệnh
  • Xác định, định danh đúng loài Kaempferia Parviflora
  • Xử lý với thuốc trừ bệnh Antracol 70WP trong 120 phút.
  • Ủ củ trong cát đã sử lý 20 – 30 ngày.
  • Các chồi mầm là nguồn vật liệu nghiên cứu

2.2 Khử trùng, tạo vật liệu khởi đầu

  • Rửa sạch dưới vòi nước củ có chồi
  • Dùng lưỡi giao mổ cắt lấy chồi có bao gồm cả phần thân củ.
  • Rửa lắc với sà phòng loãng 15 phút
  • Rửa dưới vòi nước chảy 15 phút, sau đó tráng cồn 70% trước khi đưa vào Box cấy.
  • Trong box cấy lắc khử trùng với Povidon Iod 10% 2 phút, rửa 3 lần nước cất khử trùng.
  • Khử trùng lần 1 với 6 phút HgCl 0,1%, rửa 2 lần nước cất vô trùng
  • Khử trùng lân 2 với 3 phút HgCl 0,1%, rửa 5 lần nước cất vô trùng, sau đó để lên đĩa vô trùng.
  • Dùng dao phẫu thật tách hết phần vỏ ngoài của chồi, phần thân củ. chú ý thao tác cẩn trọng không làm mất đỉnh sinh trưởng.
  • Mẫu chồi chứa đỉnh sinh trưởng là vật liệu dùng để nghiên cứu.

2.3 Nuôi cấy tạo callus

  • Môi trường tạo callus:

Thành phần

MS

(gram/lit)

Đường Succarose

(gram/lit)

Hormone 2,4D

(mg/lit)

Hormone NAA

(mg/lit)

Kinetin

(mg/lit)

Aga

(gram/lit)

pH

Tỷ lệ

4,405

30

1

1

1

7

5,75

Tiệt trùng 1 atm, 1210C, 20 phút; đổ mỗi đĩa Petri 8-10ml trước 3 ngày, quan sát và loại bỏ đĩa nhiễm nấm, khuẩn.

- Cấy các mẫu đã chuẩn bị khoảng cách 1,5x1,5cm, bọc ngoài bằng màng parapin, úp ngược đĩa để nuôi cấy.

- Điều kiện phòng nuôi cấy: nhiệt độ 25±20C; cường độ ánh sáng 2000-3000 lux; thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày.

- Kiểm tra hằng ngày để loại bỏ mẫu cấy bị nhiễm khuẩn nấm.

- Sau thời gian 8 – 12 tuần sẽ xuất hiện callus, tách callus cấy chuyển sang đĩa Petri mới để nhân tăng số lượng.

         

                            Mẫu cấy tạo callus                                                                   callus

2.4 Nuôi cấy huyền phù

  • Môi  trường nuôi cấy huyền phù

Thành phần

MS

(gram/lit)

Đường Succarose

(gram/lit)

Hormone 2,4D

(mg/lit)

pH

Tỷ lệ

4,405

30

1

5,75

Tiệt trùng 1 atm, 1210C, 20 phút

- Cấy giống: Tỷ lệ 1% trọng lượng môi trường; Dùng que cấy đánh phân tán các khối callus.

- Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ 25±20C; Cường độ ánh sáng 2000-3000 lux; Thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày; Tốc độ lắc 110 vòng/phút; Thời gian 30 ngày.

- Thu sinh khối: sau 30 ngày lọc thu sinh khối là các tế bào đơn; sấy khô ở nhiệt độ 500C.

       

Nuôi cấy huyền phù                                                           Sinh khối tươi

2.5 Kiểm tra, đánh giá sản phẩm

- Lấy 1 - 2 gram sinh khối khô chiết soxhlet bằng cồn 70%, cô khô bằng hệ thống cô quay chân không nhiệt độ ≤500C, hòa tan trong MeOH, lọc bằng màng 0,45µm.

- Định tính TLC với chất chuẩn 5,7-Dimethoxy Flavone, pha động gồm Toluene: Chloroform: Acetone: Formic acid (5: 4: 1: 0,2); Soi dưới đèn UV ở bước sóng 365nm sẽ xuất hiện vệt sáng.

Định tính TLC

GD: Củ gừng đen; C: Chất chuẩn 5,7-Dimethoxy Flavone; M2: Nuôi cấy huyền phù.

Định lượng hàm lượng trên hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi Chromater CM5000. Thiết lập phương pháp phân tích như sau: Pha động, kênh B Acetonitrile, kênh D nước bổ sung 0,5% Formic acid, dòng chảy 0,5ml/phút, bước sóng 350nm; Phương pháp chạy phân tích: 0 - 15 phút 5%B, 15 – 35 phút 50%B, 35 – 50 phút 80%B, 50 – 65 phút 100%B, 65 – 70 phút 100%B.

HPLC phân tích sản phẩm nuôi cấy huyền phù

Phụ lục 1: Thành phần MS (Murashige và Skoog)

Thành phần vi lượng

mg/l

µM

CoCl2.6H2O

0.025

0.11

CuSO4.5H2O

0.025

0.10

FeNaEDTA

36.70

100.00

H3BO3

6.20

100.27

KI

0.83

5.00

MnSO4.H2O

16.90

100.00

Na2MoO4.2H2O

0.25

1.03

ZnSO4.7H2O

8.60

29.91

 

Đa lượng

mg/l

mM

CaCl2

332.02

2.99

KH2PO4

170.00

1.25

KNO3

1900.00

18.79

MgSO4

180.54

1.50

NH4NO3

1650.00

20.61

 

Vitamins

mg/l

µM

Glycine

2.00

26.64

myo-Inositol

100.00

554.94

Nicotinic acid

0.50

4.06

Pyridoxine HCl

0.50

2.43

Thiamine HCl

0.10

0.30

 

 

[{"src":"\/resources\/upload\/images\/Quy%20trinh%20gung%20den.jpg","thumb":"\/resources\/upload\/images\/Quy%20trinh%20gung%20den.jpg","subHtml":""},{"src":"\/resources\/upload\/images\/callus1(1).jpg","thumb":"\/resources\/upload\/images\/callus1(1).jpg","subHtml":""},{"src":"\/resources\/upload\/images\/callus2.jpg","thumb":"\/resources\/upload\/images\/callus2.jpg","subHtml":""},{"src":"\/resources\/upload\/images\/Huy%C3%AA%CC%80n%20phu%CC%80%201.jpg","thumb":"\/resources\/upload\/images\/Huy%C3%AA%CC%80n%20phu%CC%80%201.jpg","subHtml":""},{"src":"\/resources\/upload\/images\/Huy%C3%AA%CC%80n%20phu%CC%80%202.jpg","thumb":"\/resources\/upload\/images\/Huy%C3%AA%CC%80n%20phu%CC%80%202.jpg","subHtml":""},{"src":"\/resources\/upload\/images\/%C4%90i%CC%A3nh%20ti%CC%81nh%201(1).jpg","thumb":"\/resources\/upload\/images\/%C4%90i%CC%A3nh%20ti%CC%81nh%201(1).jpg","subHtml":""},{"src":"\/resources\/upload\/images\/HPLC(1).png","thumb":"\/resources\/upload\/images\/HPLC(1).png","subHtml":""}]