Địa điểm tiến hành nghiên cứu: Viện y học bản địa Việt Nam
Chỉ đạo nghiên cứu: Bs Hoàng Sầm & Tiến sỹ Ngô Quang Trúc
1. Nguyên liệu, hệ thống HPLC và điều kiện sắc ký
Các dược liệu nghiên cứu được thu hái và thu thập bởi Công ty TNHH Y học bản địa Việt Nam - Chi nhánh Tả Phìn Hồ, tỉnh Hà Giang trong tháng 9 năm 2020, bao gồm 6 loài: Huperzia serrata (Thạch tùng răng cưa), Lycopodium clavatum (Thông đá), Hupezia phlegmaria (Thạch tùng đuôi ngựa), Huperzia squarrosa (Thạch tùng thân gập hay râu rồng), Huperzia hamiltonii (Thạch tùng Hamilton) và Lycopodium casuarinoides (Thông đất lá phi lao).
Máy phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi Chromaster CM-5000, đầu dò DAD, cột sắc ký Roc C18 (250mm x 4,6mm, 5µm), Restek với bước sóng đặt tại 310 nm, thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc độ dòng 1ml/phút, nhiệt độ cột 24oC.
Dung môi pha động là hỗn hợp (B) Acetonitril và (D) nước cất hai lần 0,3% formic acid. Dung môi (B) từ 0 - 3 phút, 0 - 17%; 5 - 20 phút, 25 - 33%; 20-30 phút, 50 - 68%.
Dung môi và hóa chất đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích dùng cho HPLC.
2. Chuẩn bị mẫu
Mẫu tươi sau thu hái được rửa sạch, sấy ở 90oC trong 2 - 4h, nghiền thành bột lưu trữ trong túi zip. Mỗi loại dược liệu được cân một lượng nhất định, chiết 3 lần bằng Ethanol 56% với tỷ lệ 20:1 (v/w), sonic 1h ở nhiệt độ 45 - 50oC.
Dịch chiết ethanol sau thu hồi được lọc, cô quay ở nhiệt độ 65oC, thu dịch chiết ở tỷ lệ 1/3 - 1/4 đem chuẩn pH = 2 bằng HCl 8%, chiết một lần bằng CHCl3 tỷ lệ 1:1 (v/v) để loại tạp.
Dịch chiết tổng được chuẩn pH = 8 bằng NH3 25 - 28%, chiết 3 lần bằng CHCl3 tỷ lệ 1:1 (v/v). Độ pH được so màu bằng giấy quỳ tím. Dịch chiết CHCl3 được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cô quay ở 45oC thu alkaloid tổng. Hòa tan alkaloid tổng bằng methanol (HPLC), lưu giữ trong tủ lạnh -4oC để bảo quản và sử dụng cho phân tích HPLC (Hình 1).
3. Thiết lập đường chuẩn
Chất chuẩn sử dụng (-)-Huperzine A, Sigma-Aldrich, pha loãng bằng methanol (HPLC) ở các nồng độ từ 1 - 100 ppm, phương trình hồi quy thu được: có dạng y = ax + b, hệ số tương quan yêu cầu: R2 ≥ 0,999.
4. Kết quả thí nghiệm
* Hàm lượng dịch chiết cồn sau sấy
Bảng 1: Hàm lượng dịch chiết thu được trong điều kiện thí nghiệm tính cho 1 g mẫu khô
|
|
| Hàm lượng dịch (g) |
| 1 | Thạch tùng răng cưa | 0,2277 |
| 2 | Thạch tùng đuôi ngựa | 0,2940 |
| 3 | Thạch tùng thân gập | 0,1455 |
| 4 | Thạch tùng đá | 0,2670 |
Ghi chú: Kết quả thí nghiệm trên được thực hiện khi chưa thu thập được 2 loài Thạch tùng Hamilton và Thạch tùng phi lao
Hình 1. Quy trình chiết tách alkaloid tổng số
* Kết quả khảo sát tuyến tính Huperzine A dùng cho định lượng trên HPLC
Chất chuẩn sử dụng (-)-Huperzine A, Sigma-Aldrich, pha loãng bằng methanol (HPLC) ở 4 nồng độ từ 1, 10, 50 và 100 ppm, phương trình hồi quy thu được y = 176260x + 153672, hệ số tương quan R2 = 0,9996. Hệ số a và b có ý nghĩa với độ tin cậy 95%.
Bảng 2: Hàm lượng Hup A trong các loài thông đất Tả Phìn Hồ
| TT | Tên dược liệu | Ký hiệu | mg Hup A trong 1kg mẫu khô |
| 1 | Thạch tùng thân gập | TG | 90,218 |
| 2 | Thạch tùng phi lao | TTL | 159,535 |
| 3 | Thạch tùng đuôi ngựa | DN | 40,653 |
| 4 | Thạch tùng đá | TTD | 0,543 |
| 5 | Thạch tùng răng cưa | RC | 255,459 |
| 6 | Thạch tùng Hamilton | TTH | 44,336 |
* Hình ảnh sắc ký đồ của một số loài họ thông đất tại Tả Phìn Hồ, Hà Giang
Hình 2. Sắc ký đồ Thạch tùng thân gập
Hình 3. Sắc ký đồ Thạch tùng phi lao
Hình 4. Sắc ký đồ Thạch tùng đuôi ngựa
Hình 5. Sắc ký đồ Thạch tùng đá
Hình 6. Sắc ký đồ Thạch tùng răng cưa
Hình 7. Sắc ký đồ Thạch tùng Hamilton
Nhóm nghiên cứu
TS. Hoàng Lâm
CN. Hoàng Văn Nam
DS. Nguyễn Thu Trang
