Báo cáo sơ bộ kết quả nghiên cứu định lượng huperzine A một số loài họ Thạch tùng ở Tả Phìn Hồ., Hà Giang

Địa điểm tiến hành nghiên cứu: Viện y học bản địa Việt Nam

Chỉ đạo nghiên cứu: Bs Hoàng Sầm & Tiến sỹ Ngô Quang Trúc

1. Nguyên liệu, hệ thống HPLC và điều kiện sắc ký

Các dược liệu nghiên cứu được thu hái và thu thập bởi Công ty TNHH Y học bản địa Việt Nam – Chi nhánh Tả Phìn Hồ, tỉnh Hà Giang trong tháng 9 năm 2020, bao gồm 6 loài: Huperzia serrata (Thạch tùng răng cưa), Lycopodium clavatum (Thông đá), Hupezia phlegmaria (Thạch tùng đuôi ngựa), Huperzia squarrosa (Thạch tùng thân gập hay râu rồng), Huperzia hamiltonii (Thạch tùng Hamilton) và Lycopodium casuarinoides (Thông đất lá phi lao).

Máy phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi Chromaster CM-5000, đầu dò DAD, cột sắc ký Roc C18 (250mm x 4,6mm, 5µm), Restek với bước sóng đặt tại 310 nm, thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc độ dòng 1ml/phút, nhiệt độ cột 24^oC.

Dung môi pha động là hỗn hợp (B) Acetonitril và (D) nước cất hai lần 0,3% formic acid. Dung môi (B) từ 0 – 3 phút, 0 – 17%; 5 – 20 phút, 25 – 33%; 20-30 phút, 50 – 68%.

Dung môi và hóa chất đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích dùng cho HPLC.

2. Chuẩn bị mẫu

Mẫu tươi sau thu hái được rửa sạch, sấy ở 90^oC trong 2 – 4h, nghiền thành bột lưu trữ trong túi zip. Mỗi loại dược liệu được cân một lượng nhất định, chiết 3 lần bằng Ethanol 56% với tỷ lệ 20:1 (v/w), sonic 1h ở nhiệt độ 45 – 50^oC.

Dịch chiết ethanol sau thu hồi được lọc, cô quay ở nhiệt độ 65^oC, thu dịch chiết ở tỷ lệ 1/3 – 1/4 đem chuẩn pH = 2 bằng HCl 8%, chiết một lần bằng CHCl₃ tỷ lệ 1:1 (v/v) để loại tạp.

Dịch chiết tổng được chuẩn pH = 8 bằng NH₃ 25 – 28%, chiết 3 lần bằng CHCl₃ tỷ lệ 1:1 (v/v). Độ pH được so màu bằng giấy quỳ tím. Dịch chiết CHCl₃ được làm khan bằng Na­₂SO₄, lọc và cô quay ở 45^oC thu alkaloid tổng. Hòa tan alkaloid tổng bằng methanol (HPLC), lưu giữ trong tủ lạnh -4^oC để bảo quản và sử dụng cho phân tích HPLC (Hình 1).

3. Thiết lập đường chuẩn

Chất chuẩn sử dụng (-)-Huperzine A, Sigma-Aldrich, pha loãng bằng methanol (HPLC) ở các nồng độ từ 1 – 100 ppm, phương trình hồi quy thu được: có dạng y = ax + b, hệ số tương quan yêu cầu: R2 ≥ 0,999.

4. Kết quả thí nghiệm

* Hàm lượng dịch chiết cồn sau sấy

Bảng 1: Hàm lượng dịch chiết thu được trong điều kiện thí nghiệm tính cho 1 g mẫu khô

Ghi chú: Kết quả thí nghiệm trên được thực hiện khi chưa thu thập được 2 loài Thạch tùng Hamilton và Thạch tùng phi lao

Hình 1. Quy trình chiết tách alkaloid tổng số

* Kết quả khảo sát tuyến tính Huperzine A dùng cho định lượng trên HPLC

Chất chuẩn sử dụng (-)-Huperzine A, Sigma-Aldrich, pha loãng bằng methanol (HPLC) ở 4 nồng độ từ 1, 10, 50 và 100 ppm, phương trình hồi quy thu được y = 176260x + 153672, hệ số tương quan R² = 0,9996. Hệ số a và b có ý nghĩa với độ tin cậy 95%.

Bảng 2: Hàm lượng Hup A trong các loài thông đất Tả Phìn Hồ

* Hình ảnh sắc ký đồ của một số loài họ thông đất tại Tả Phìn Hồ, Hà Giang

Hình 2. Sắc ký đồ Thạch tùng thân gập

Hình 3. Sắc ký đồ Thạch tùng phi lao

Hình 4. Sắc ký đồ Thạch tùng đuôi ngựa

Hình 5. Sắc ký đồ Thạch tùng đá

Hình 6. Sắc ký đồ Thạch tùng răng cưa

Hình 7. Sắc ký đồ Thạch tùng Hamilton

Nhóm nghiên cứu

TS. Hoàng Lâm
CN. Hoàng Văn Nam
DS. Nguyễn Thu Trang