MỘT ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG DỰA TRÊN BENZOTHIAZOLE ĐỂ PHÁT HIỆN AXIT HYPOCHLOROUS VÀ HÌNH ẢNH TRONG TẾ BÀO SỐNG
Khac Hong Nguyen[1], Yuanqiang Hao, Ke Zeng, Shengnan Fan, Fen Li, Suke Yuan, Xuejing Ding, Maotian Xu, and You-Nian Liu
1. GIỚI THIỆU
Các loài oxy phản ứng (ROS - Reactive Oxygen Species) ngày càng được chú ý do vai trò thiết yếu của chúng trong sinh học và sự liên quan của chúng đối với nhiều bệnh. Trong số các ROS đã biết, axit hypochlorous (HClO), được sản xuất sinh học từ hydrogen peroxide (H2O2) và ion clorua (Cl–) theo phương pháp enzym MPO (myeloperoxidase), hoạt động như một chất diệt vi khuẩn mạnh mẽ trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh trong quá trình xâm nhập của mầm bệnh. Ngoài ra, là một chất oxy hóa mạnh, HClO cũng có thể phản ứng với các axit amin, protein, cholesterol và nucleoside, dẫn đến ức chế các chức năng phân tử sinh học khác nhau. Hơn nữa, có báo cáo rằng việc sản xuất HClO bất thường có liên quan chặt chẽ đến một số bệnh, bao gồm bệnh tim mạch, bệnh viêm, một số bệnh ung thư và rối loạn thoái hóa thần kinh. Do đó, việc phát triển các kỹ thuật chính xác và đáng tin cậy để phát hiện và hình ảnh HClO trong tế bào sống là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về chức năng sinh lý và bệnh lý của nó.
Hình ảnh huỳnh quang dựa trên các đầu dò tổng hợp là một công cụ mạnh mẽ để cảm nhận HClO cả in vivo và in vitro do các ưu điểm độc đáo của nó, chẳng hạn như độ nhạy cao, khả năng phân giải không gian và thời gian, đơn giản để thực hiện và phân tích thời gian lại. Là một chất oxy hóa và clo hóa mạnh, HClO có thể làm trung gian cho các phản ứng cụ thể đối với một số nguyên tố, chẳng hạn như các nguyên tử chalcogenide (S,Se,Te), dibenzoylhydrazine, acylhydrazone, hydroxylamine, hydrazone, bazơ Schiff, anken thiếu điện tử , p-metoxyphenol, 1,8-diaminonaphtalen, v.v. Trên cơ sở các phản ứng cụ thể này của HClO, nhiều loại đầu dò huỳnh quang đã được báo cáo để phát hiện HClO bằng cách sử dụng các nhóm đầu soi huỳnh quang bao gồm oxazine, Si-rhodamine, fluorescein, BODIPY, acedan, thuốc nhuộm cyanin, fluorenone, coumarin, phức hợp iridium (III), naphthalimide, phenanthroimidazole, (2-hydroxyphenyl)benzothiazole(HBT), 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole. Trong số các đầu soi huỳnh quang được sử dụng này, HBT và các dẫn xuất của nó đã thu được rất nhiều lợi ích do khả năng của chúng để trải qua quá trình truyền photon nội phân tử ở trạng thái kích thích (ESIPT) khi bị kích thích quang thông qua phương pháp tautomerism keto-enol, dẫn đến sự thay đổi Stokes lớn và hành vi huỳnh quang tỷ lệ duy nhất.
Lấy cảm hứng từ những hiểu biết sâu sắc này, chúng tôi đã báo cáo việc bật đầu dò huỳnh quang dựa trên HBT để phát hiện HClO. Đầu dò thu được bằng cách ngưng tụ HBT với NH2–OH. Do sự khử hoạt tính không bức xạ thông qua quá trình đồng phân hóa C = N, đầu dò phát quang yếu. Sự hình thành oxit nitril cụ thể qua trung gian HClO có thể tạo ra một dẫn xuất có tính phát xạ cao. Sự biến đổi này của đầu dò gây ra bởi HClO đã được xác nhận bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao-khối phổ (HPLC-MS). Đầu dò mới thể hiện độ nhạy cao với giới hạn phát hiện thấp là 0,08 μM, cũng như tính chọn lọc tuyệt vời đối với HClO so với các loài có liên quan khác. Hơn nữa, đầu dò hiển thị tính thấm màng tế bào tuyệt vời và độc tính tế bào thấp, và đã được áp dụng thành công để tạo hình ảnh HClO trong tế bào sống.
2. THỰC NGHIỆM
2.1. Vật liệu và dụng cụ
Tất cả các thuốc thử được mua từ các nhà cung cấp thương mại và được sử dụng như đã nhận. Nước khử ion đã được sử dụng trong suốt các thí nghiệm phân tích. Quang phổ huỳnh quang được thực hiện trên máy quang phổ huỳnh quang Varian Cary Eclipse (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Phổ độ hấp thụ được ghi lại bằng máy quang phổ UV-Vis Cary 60 Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, Hoa Kỳ). Phổ NMR được ghi trên Bruker 400 MHz. Phép đo khối phổ được thực hiện trên máy đo khối phổ Xevo G2-S Q-TOF (Waters, Milford, MA, USA). Phân tích HPLC được thực hiện trên hệ thống Waters Acquity UPLC H-Class (Milford, MA, Hoa Kỳ) được trang bị hệ thống phân phối dung môi bậc bốn, tủ sấy cột, bộ lấy mẫu tự động và bộ dò dãy photodiode. Các chất phân tích được tách ở chế độ gradient với cột Waters Acquity BEH 2,1 × 50 mm C18 1,7 μm. Lò cột được giữ ở 40oC. Tốc độ dòng chảy là 0,3 mL / phút. Các thành phần rửa giải là nước (A) và axetonitril (B). Gradient pha động như sau: 0,0 phút 50% B → 4,0 phút 100% B → 5,0 phút 50% B.
2.2. Quy trình chung để phân tích
Dung dịch gốc của mẫu dò 1 (10 mM) được chuẩn bị trong etanol tuyệt đối. Dung dịch thử nghiệm của đầu dò 1 được pha loãng trong dung dịch hỗn hợp của đệm photphat: C2H5OH = 9: 1 (v / v, pH 7,4, 10 mM) và thêm các phần nhỏ của từng dung dịch loại thử nghiệm. Tất cả các quang phổ thu được trong cuvet thạch anh (chiều dài đường dẫn = 1 cm) ở nhiệt độ phòng.
2.3. Hình ảnh huỳnh quang
Các tế bào Hela nuôi cấy được ủ với đầu dò 1 (10 μM), đầu dò 1 (10 μM) và do đó với ClO– (20 μM) trong DMEM (môi trường Eagle cải tiến của Dulbecco) ở 37oC, tương ứng. Thời gian ủ được đặt là 1h. Sau khi ủ trong thời gian tương ứng, các tế bào được rửa bằng PBS ba lần để loại bỏ hợp chất và ion tự do trước khi phân tích. Chụp ảnh huỳnh quang được thực hiện với Olympus IX 71 với đèn xenon và máy ảnh kỹ thuật số Olympus. Sự phát huỳnh quang trong các kênh màu xanh lục được hình dung bằng các bộ lọc phát xạ thích hợp.
2.4. Thử nghiệm khả năng sống của tế bào
Độc tính của mẫu dò 1 đối với tế bào sống được xác định bằng các xét nghiệm MTT (3- (4,5- dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide). Ba loại liens tế bào (tế bào HeLa, L929 và MDA-MB-231) đã được đánh giá. Các tế bào được gieo trong các đĩa 96 giếng với mật độ 5×103 tế bào mỗi giếng và được nuôi cấy trong 24h ở 37oC với 5% CO2 trong môi trường ẩm. Sau đó, một loạt các nồng độ của các đầu dò (0, 5, 10, 15 và 20 μM) được thêm vào các giếng đã tách, và các tế bào được ủ thêm 24h. Dung dịch MTT sau đó được thêm vào từng giếng và dung dịch MTT dư được loại bỏ sau 4h. Các tinh thể MTT-formazan được hòa tan trong 200 μL DMSO. Độ hấp thụ của mỗi giếng được đo bằng đầu đọc vi tấm (Bio-TekELx800) ở bước sóng 490 nm. Khả năng sống sót của tế bào được đánh giá bằng cách sử dụng Công thức sau: Khả năng tồn tại của tế bào (%) = AT / A0 × 100%
Trong đó AT là độ hấp thụ của các tế bào được xử lý và A0 là độ hấp thụ kiểm soát. Dữ liệu về khả năng sống sót của tế bào được đưa ra dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (S.D.).
2.5. Tổng hợp đầu dò 1
Scheme 1 Synthesis of probe 1.
Việc tổng hợp đầu dò 1 được thể hiện trong sơ đồ 1. Hợp chất 2 và 3 được tổng hợp theo các quy trình đã báo cáo trước đây.
Hợp chất 2 (0,135 g, 0,5 mmol) và hydroxylamin hydroclorid (0,069 g, 1,0 mmol) được hòa tan trong etanol tuyệt đối (30 mL). Trietylamin (0,11 g, 1,1 mmol) được thêm vào dung dịch, và sau đó hỗn hợp được hồi lưu dưới 800C trong 5h. Các chất bay hơi sau đó được loại bỏ dưới áp suất giảm, và phần còn lại được đưa vào DCM (diclometan) và rửa bằng H2O trong ba lần. Lớp hữu cơ là làm khô trên Na2SO4, lọc, và sau đó làm khô trong chân không. Tinh chế qua sắc ký cột sử dụng DCM / MeOH làm chất rửa giải (100: 3, v / v) thu được 1 ở dạng chất rắn màu trắng (0,183 mg, 65%).
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phản ứng quang phổ của đầu dò 1 với ClO–
Các phản ứng phổ của đầu dò 1 đối với ClO– được khảo sát bằng cả chuẩn độ UV-Vis và chuẩn độ huỳnh quang trong dung dịch H2O-EtOH (9: 1, v/v, đệm phosphat 10 mM, pH 7,4). Như thể hiện trong Hình 1, Đầu dò 1 hiển thị dải hấp thụ chính khoảng 350 nm. Sau khi bổ sung ClO–, một dải hấp thụ yếu ở bước sóng 410 nm dần dần xuất hiện với sự giảm nhẹ độ hấp thụ ban đầu ở bước sóng 350 nm. Sự chuyển dịch sắc độ này có thể là do quá trình ICT nâng cao (chuyển điện tích nội phân tử) trong sản phẩm bị oxy hóa của 1 bởi ClO–, vì oxit nitrile được tạo ra là nhóm rút điện tử mạnh hơn so với hydroxylamine chưa phản ứng. Hình 1B cho thấy các phản ứng huỳnh quang của đầu dò 1 với ClO–. Đầu dò 1 thể hiện huỳnh quang yếu trong điều kiện không có HClO ở bước sóng 350 nm do quá trình phân rã đồng phân hóa C = N. Cho HClO vào dung dịch 1 dẫn đến sự tăng cường huỳnh quang rõ ràng ở bước sóng 540 nm, có thể được coi là sự chuyển đổi nhóm hydroxylamine dập tắt bởi ClO–. Ngoài ra, mối quan hệ tuyến tính tốt thu được giữa cường độ huỳnh quang ở bước sóng 540 nm và nồng độ HClO trong khoảng 0,5–18,0 μM (trong Hình 1B). Giới hạn phát hiện được ước tính là 0,08 μM dựa trên 3σ. Hiệu suất của đầu dò 1 được so sánh với các ClO– huỳnh quang gốc hydroxylamine khác nhau (được liệt kê trong Bảng S1). Đầu dò được đề xuất thể hiện hiệu suất phân tích có thể so sánh hoặc vượt trội về các khía cạnh của môi trường phát hiện, độ dịch chuyển Stokes và giới hạn phát hiện.
Fig. 1. UV-Vis spectra (A) and fluorescence spectra (B) of probe 1 (10 µM) in H2O- EtOH solution (9:1, v/v, 10 mM phosphate buffer, pH 7.4) upon addition of various concentrations of ClO– (0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 16.0 18.0, and
20.0 μM). Inset shows the linear fitting curve between the fluorescence intensity at 540 nm and the concentration of ClO–. λex = 350 nm.
Sau đó, đánh giá sự phụ thuộc vào thời gian của phản ứng huỳnh quang của đầu dò đối với HClO. Với sự có mặt của ClO–, dung dịch thăm dò cho thấy cường độ phát xạ tăng lên đáng kể ở bước sóng 540 nm (Hình S4). Trong điều kiện bậc nhất giả, hằng số tốc độ phản ứng (k ’) được tính là 3,9 × 10–3 s–1. Và cường độ phát xạ đạt cực đại trong 15 phút, cho thấy rằng đầu dò 1 có khả năng phát hiện ClO– trong thời gian thực. Tính chọn lọc của đầu dò 1 đối với các ROS khác nhau và các nhiễu khác đã được khảo sát. Đầu dò có phản ứng ClO– cao hơn 100 lần so với các loài khác, chẳng hạn như tBuOOH, Fe3+, H2O2, NO, 1O2, • OH,• O2– và TBHP (tert-butyl hydroperoxide), chỉ ra rằng đầu dò 1 có tính chọn lọc cao đối với ClO– (xem Hình 2). Phản ứng huỳnh quang cụ thể này của đầu dò 1 đối với ClO– cũng có thể được hình dung dưới Đèn UV cầm tay (Hình 2B).
Fig. 2. (A) Fluorescence spectra of probe 1 (10 µM) in H2O-EtOH solution (9:1, v/v,10 mM phosphate buffer, pH 7.4) in the presence of various ROS and other interferences (20 µM); (B) Fluorescence intensity changes at 540 nm (λex = 350 nm). The inset shows the corresponding visual fluorescence change photograph of the probe solution for ClO– and interferences under a Handheld UV Lamp (λex = 365 nm).
3.2. Cơ chế cảm biến
Fig. 3. Proposed sensing mechanism of probe 1 towards ClO– and the frontier orbital diagram of probe 1 and its speculated products.
Hydroxylamine đã được sử dụng thành công như một gốc công nhận để chế tạo các đầu dò ClO– huỳnh quang. Nhưng nhóm hydroxylamine này trong các đầu dò khác nhau có thể bị oxy hóa thành các loài khác nhau bởi ClO–, chẳng hạn như aldehyde, nitrile oxide, axit cacboxylic. Để hiểu rõ hơn về cơ chế cảm nhận của đầu dò 1 đối với ClO–, quá trình phản ứng được theo dõi bởi HPLC-MS (xem Hình S5). Sắc ký đồ HPLC của đầu dò 1 cho thấy một pic duy nhất có thời gian lưu (Rt) ở 3,17 phút, tương ứng với giá trị m/z là 258,01. Sau khi ủ với ClO– (1 đương lượng) trong 15 phút (Hình S5B), một pic sắc ký mới đã xuất hiện (Rt = 3,60 phút) với giá trị m/z là 252,99, có thể được coi là dẫn xuất nitril oxit được tạo ra ( cal. 253.05). Các kết quả HPLC-MS này chỉ ra rõ ràng sự chuyển đổi của đầu dò 1 thành sản phẩm oxit nitrile của nó như được mô tả trong Hình 3. Để kiểm tra thêm mối quan hệ giữa các thay đổi cấu trúc điện tử và phản ứng quang học của đầu dò 1 với ClO–, một tính toán lý thuyết đã được thực hiện bằng Lý thuyết hàm mật độ (DFT) với bộ cơ sở phương pháp B3LYP/6-31 + G (d, p) sử dụng chương trình Gaussian 09. Hình 3 trình bày sơ đồ quỹ đạo biên giới, quỹ đạo phân tử bị chiếm dụng cao nhất (HOMO) và quỹ đạo phân tử không bị chiếm dụng thấp nhất (LUMO), của đầu dò 1 và các sản phẩm tương ứng. Do nhóm oxit nitrile được tạo ra, sản phẩm hiển thị giảm mức năng lượng của cả LOMO và HOMO, và khoảng cách năng lượng nhỏ hơn, phù hợp với sự chuyển dịch màu đỏ của phổ UV-Vis.
3.3. Hình ảnh tế bào
Fig. 4. Fluorescence images of live Hela cells. Cells incubated with 10 µM probe 1 for 60 min at 37 °C (A, B). Probe 1 loaded cells after treatment with 20 µM ClO– for 60 min at 37°C (C, D). (A) and (C) are bright-field images. Scale bar represents 20 μm in all images.
Chúng tôi tiếp tục tìm cách áp dụng đầu dò 1 để tạo ảnh huỳnh quang của ClO– trong tế bào sống. Các tế bào HeLa được nạp với đầu dò 10 µM trong 1h ở 37oC cho thấy huỳnh quang mờ cho thấy rằng đầu dò có khả năng thấm qua tế bào (Hình 4B). Việc bổ sung 20 µM ClO– vào các tế bào HeLa được nạp với đầu dò 1 dẫn đến sự gia tăng đáng kể huỳnh quang nội bào so với các tế bào đối chứng không được xử lý bằng ClO– (Hình 4D). Hơn nữa, độc tính tế bào của mẫu dò 1 đối với các loại tế bào khác nhau đã được đánh giá bằng xét nghiệm MTT. Tất cả các tế bào được kiểm tra này vẫn ở tình trạng tốt sau 24h ủ với các nồng độ khác nhau (0–20 μM) của mẫu dò 1 (Hình S6), có thể cho rằng độ độc tế bào thấp của mẫu dò 1. Các thí nghiệm tế bào này chứng minh rằng mẫu dò 1 tương thích sinh học, màng tế bào thấm, và có thể được sử dụng để theo dõi ClO– trong tế bào sống.
4. KẾT LUẬN
Tóm lại, một đầu dò huỳnh quang bật mới (Đầu dò 1) đối với ClO– bằng cách ngưng tụ fluorophore HBT đã được anđehit với gốc nhận biết là hydroxylamine đã được trình bày. Đầu dò 1 hiển thị phản ứng huỳnh quang nhạy cảm và chọn lọc đối với ClO– so với ROS khác thông qua sự biến đổi đặc hiệu gây ra ClO của nhóm hydroxylamine dập tắt thành nitrile oxit trong đầu dò 1. Cơ chế phản ứng đã được xác nhận bởi HPLC-MS. Hơn nữa, đầu dò 1 thể hiện khả năng tương thích sinh học và tính thấm màng tế bào tuyệt vời, và có thể được sử dụng để theo dõi ClO– trong tế bào sống. Đầu dò mới này cung cấp một mô hình mới để phát hiện và xác định mô hình sinh học ROS trong tế bào sống.
[1] Công trình được tác giả và các cộng sự thực hiện trong khoảng thời gian từ 2014-2017, được đăng trên tạp chí SCI Spectrochimica Acta của nhà xuất bản Elsevier
TÀI LIỆU THAM KHẢO
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29604608/
.jpg)
