TÓM TẮT ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY BÁN HẠ BA THUỲ [1]

I. ĐỐI TƯỢNG VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

- Cây Bán hạ ba thùy có tên khoa học là Typhonium trilobatum, họ Araceae thuộc loài thực vật thân thảo. Những nghiên cứu về dược lý cũng như  thành phần hóa học của nó còn ít. Đó là những cơ sở để lựa chọn cây Typhonium trilobatum làm đối tượng nghiên cứu nhằm xây dựng cơ sở khoa học để có thể khai thác, sử dụng hợp lý và an toàn một cây thuốc dân gian của Y học cổ truyền Việt Nam.

- Nhiệm vụ của luận văn này là nghiên cứu thành phần hóa học một số dịch chiết của cây Bán hạ ba thùy.

II. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN

- Lần đầu tiên cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobtum) mọc hoang dại ở vùng Đông  Dương, Việt Nam được nghiên cứu sàng lọc hóa thực vật, đã thu được một hỗn hợp các axit béo và phân lập được 5 hợp chất hữu cơ, trong số đó có 3 hợp chất đã biết là các chất khung sterol. Lần đầu tiên phân lập được 1 hợp chất Cerebrozit trong cây Typhonium trilobatum, đặt tên là Typhotrilozit A và một chất terpen-glycozit (RTtE1).

- Dựa vào các đặc trưng vật lý, các phổ IR, MS, ¹H- và ¹³C-NMR của mỗi chất, đã nhận dạng được 3 trong số 5 chất, đó là các sterol: stigmast-5,22-dien-3b-ol (RTtH6), b-sitosterol (RTtH7), 3-O-b-D-glucopyranosyl-stigmasterol (RTtE2).

- Hai chất còn lại dựa vào số liệu các phổ đã có có thể khẳng định 1 chất  thuộc lớp chất terpen-glycozit (RTtE1), chất còn lại là một cerebrozit: Typhotrilozit A (RTtE3), đây có thể là một chất mới.

III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Phương pháp thu thập và định danh mẫu nghiên cứu

Cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) mọc hoang ở Nam Định, Thái Bình, Quảng Ninh, Hòa Bình.v.v. Mẫu nghiên cứu được thu hái ở Đông Chiều - Quảng Ninh vào tháng 7 năm 2007 dùng làm đối tượng nghiên cứu. Mẫu cây đã được TS. Ninh Khắc Bản – Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh học – Viện KH và CN Việt Nam giám định tên khoa học là Typhonium trilobatum họ Araceae, tiêu bản được lưu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh học.

3.2. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

          Sử dụng các phương pháp chiết chọn lọc thích hợp, các loại sắc ký cột khác nhau (CC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất tinh khiết. Khảo sát các hằng số vật lý (màu, mùi, dạng thù hình, điểm nóng chảy, R_fx100 ...), ghi các phổ, IR, MS, ¹H và ¹³C-NMR với các kỹ thuật 1D và 2D cần thiết khác nhau.

3.3. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

- Sắc ký cột thường sử dụng Silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh, sắc ký lớp mỏng (SKLM) loại đế nhôm  DC-Alufolien Kieselgel 60F₂₅₄ Art.5554 .  Các hệ dung môi triển khai SKLM:

 1. n-Hexan-EtOAc (8:1)             Hệ  A     

 2. n-Hexan-EtOAc   (4:1)              Hệ   B

 3. CHCl₃-metanol     (9:1)             Hệ  C     

 4. CHCl₃-metanol   (5:1)              Hệ   D

 5. CHCl₃-metanol    (2:1)             Hệ E

- Hiện màu: Dưới đèn tử ngoại (UV-BIOBLOCK) ở bước sóng l=254nm (365nm) hoặc được phun thuốc thử Vanilin 1% trong metanol /H₂SO₄ và sấy trên 100⁰C hoặc đưa vào buồng I2 .

- Thiết bị đo: - Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boëtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. Góc quay cực [a]_D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm.

- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT-410 (Viện Hoá học - Viện KH và CN Việt Nam) dạng viên nén KBr.

- Phổ khối ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm electron (EI-MS) 70eV, và xử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L.

- Phổ ¹H-NMR và ¹³C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE (Viện Hoá học - Viện KH và CN Việt Nam), nội chuẩn TMS, dung môi CDCl₃ , DMSO-d6.

3.4. Quy trình ngâm chiết

-Mẫu khô đem nghiền nhỏ, ngâm chiết nhiều lần trong etanol 100%, cô quay được cặn khô. Cặn khô được hoà tan trong các dung môi từ ít phân cực đến phân cực nhiều: n-hexan, etyl acetat, methanol. Sau đó tiến hành phân lập và tinh chế các hợp chất từ các dịch chiết

Sơ đồ 2.1.  Qui trình ngâm chiết

3.5. Xác định cấu trúc hóa học các chất trong cây Typhonium trilobatum

          Từ các dịch chiết n-hexan, etylaxetat của thân, lá, củ và rễ cây Bán hạ ba thùy đã thu được một hỗn hợp các axit béo và phân lập được 5 hợp chất . Dựa vào máy đo phổ GC/MS trong đó có so sánh với mẫu phổ chuẩn với độ chính xác cao đã xác định được 5 axit béo. Dựa vào các hằng số vật lý như: điểm nóng chảy, góc quay cực, và các số liệu phổ  IR, MS, ¹H và ¹³C-NMR đã nhận dạng được 3 trong số 5 hợp chất. Chúng thuộc các nhóm chất sterol, 1 hợp chất mới thuộc nhóm  cerebrozit  và đặt tên là typhotrilozit A và một chất terpen-glycozit.

3.5.1  Các axit béo

   Các axit béo trong hỗn hợp thu được gồm: axit hexadecanoic; axit 11,14-octadecadienoic; 9,12-octadecadienoic; axit cis-linoleic; axit docosanoic.

Hỗn hợp các axit béo được phân tích trên máy GC/MS có so sánh với ngân hàng phổ với độ chính xác cao, được tóm tắt ở bảng 3.1

3.5.2 Các hợp chất sterol

*  Stigmast-5,22-dien-3-b-ol (RTtH6): Tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 155-157⁰C. Phổ EI-MS cho pic ion phân tử [M⁺] (412) ứng với công thức phân tử C₂₉H₄₈O. Các số liệu phổ FT-IR, ¹H và ¹³C-NMR phù hợp với các tài liệu đã công bố.

* b-Sitosterol (RTtH7): Tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 138-140⁰C. Phổ EI-MS cho pic ion phân tử [M]⁺ (414) ứng với công thức phân tử C₂₉H₅₀O. Các số liệu phổ FT-IR, ¹H và ¹³C-NMR phù hợp với các tài liệu đã công bố.

* 3-O-b-D-glucopyranosyl-stigmasterol (RTtE2): Tinh thể hình kim không màu có nhiệt độ nóng chảy 289-290 ⁰C, R_fC=48. Các dữ liệu về phổ ¹H-NMR và ¹³C-NMR so với dữ liệu chuẩn đã xác định được là 3-O-b-D-glucopyranosyl-stigmasterol.

3.5.3.  Hợp chất terpen-glycozit (RTtE1)

Chất rắn kết tinh vô định hình không màu, có điểm nóng chảy 279-281⁰C. Phổ ¹H-NMR (CDCl₃/MeOD-d6,  500MHz), d (ppm): 0,65-2,35 là tín hiệu các nguyên tử H của các nhóm CH₃, CH₂ và CH trong mạch các bon; 3,95-4.85 là tín hiệu các mguyên tử H của các nhóm CH₂và CH liên kết trực tiếp với O của phần đường và khung terpen ; 4,85 (d, H-1’phần đường ); 5-5,53 là tín hiệu các nguyên tử H của các liên kết olefin.

Phổ ¹³C-NMR (CDCl₃/MeOD-d6, 125MHz) :d (ppm): 11,8-57 là tín hiệu các nguyên tử C trong khung terpen, 61,8-77,7 là tín hiệu các nguyên tử C liên kết trực tiếp với O của phần đường và khung genin, 102,1 (C-1’ phần đường ), 121,6 và 123 tín hiệu các nguyên tử C olefin.

Qua số liệu các phổ NMR đã thu được có thể khẳng định RTtE1 là một terpen-glycozit, để có được cấu trúc hóa học hoàn thiện của nó cần có những nghiên cứu tiếp theo.

3.5.4.  Hợp chất typhotrilozit A (RTtE3)

    Từ dịch chiết etylaxetat củ, rễ của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) đã thu được một hợp chất rắn kết tinh dạng vô định hình, màu xám, có điểm nóng chảy 189-190⁰C, không tan trong nước, tan ít trong metanol, nhưng tan rất tốt trong hệ dung môi CHCl₃/MeOH (tỷ lệ 2:1 v/v).

   Trong phổ quan sát thấy các hấp thụ đặc trưng ở tần số 3380,35; và 3365 cm^-1 là dao động của các liên kết O-H hoặc N-H, ở 2917,06 và 2815 cm^-1 là dao động của các liên kết hóa trị C-H ; tại 1646,5 cm^-1 (rất mạnh) là dao động của liên kết C=O amit bậc I; ở 1622 cm^-1 là dao động của liên kết olefin (C=C), ở 1537,0 cm^-1 là dao động biến dạng của liên kết NH amit; còn tại 1087,8  cm^-1 là dao động của liên kết C-O-C và ở 651 cm^-1 là dao động biến dạng của liên kết C-H.

Qua việc phân tích các số liệu phổ ¹H-NMR, ¹³C-NMR, DEPT-135, DEPT-90, HMQC và HMBC của nó, có thể thấy hợp chất này có chỉ chứa một gốc đường b-D-glucopyranozơ, có nguyên tử H-1'' ở d_H 4,12 ppm (1H, d, JH-1"-H-2" 7,8Hz), và phần genin là một gốc ceramit. Từ các phổ DEPT-90 và DEPT-135 cho biết, trong toàn bộ phân tử RTtE3 có 15 nhóm CH. Ngoài ra, phổ DEPT-135 của nó còn cho biết thêm, trong RTtE3 còn có 2 nhóm CH2 liên kết trực tiếp với ôxi.

Trong phổ ¹H-NMR, có thể quan sát thấy độ dịch chuyển hóa học (dH) của một nguyên tử Ha ở 7,37 ppm (d, JHa-H2 =7,3Hz) đây là tín hiệu của nguyên tử Ha (NH) thuộc amit bậc 1, rất phù hợp với dao động hóa trị của liên kết CO amit ở tần số n_max=1646,5  và 1537 cm^-1 trong phổ FT-IR, đồng thời cũng quan sát thấy có sự tương tác xa giữa nguyên tử Ha (NH) trong nhóm amit này với nguyên tử C-1’ trong nhóm carbonyl có d_C ở 173,7 ppm và với nguyên tử C-2 trong nhóm metin (CH) cận kề. Theo phổ HMQC của chất (RTtE3), thì một nguyên tử H có dH ở 4,12 ppm, d, JH-H = 7,8 Hz có thể khẳng định đây là H-1" thuộc phần đường b-D-glucozơ, có thể quan sát thấy tương tác xa giữa nó và nguyên tử C-1 của gốc aminoancol trong phần genin và C-2" trong phần đường. Các độ dịch chuyển hóa học (d_H) của các nguyên tử H thuộc các nhóm metin trong phần đường có d_H nằm trong khoảng 2,9 – 3,8 ppm. Một nguyên tử H có d_H ở 3,81 ppm thuộc nhóm metin (CH), đây là nguyên tử H-2, cũng có thể quan sát thấy tương tác xa của nó với các nguyên tử C-1 và C-3 trong phổ HMBC. Còn nguyên tử H có d_H ở 4,6 ppm, chính là H-3 trong phần aminoancol và cũng có thể quan sát thấy tương tác xa giữa nguyên tử H này với các nguyên tử C-2 và C-4 trong phổ HMBC.

Hợp chất RTtE3 được thủy phân bằng axit HCl 1M  trong  metanol,  thu  được  một este metyl- 2-hidrocacboxylat (RTtE3.1). Phổ EIS/MS của nó cho pic phân tử là 380 (M⁺) phù hợp với công thức phân tử C₂₄H₄₄O₃. Phổ ¹H-NMR cho biết một số độ dịch chuyển hóa học đặc trưng của một số nguyên tử H như: 4,06 (H, t, H-2), 3,79 (3H, s, CH₃-O), 0,89 (3H, t, 8,7); 5,2-5,65 (m, H-olefin). Còn từ phổ ¹³C-NMR của nó có thể khẳng định được một số nguyên tử C có độ dịch chuyển hóa học như sau: 179,7 (C-1’); 127,9;128,1; 130,1 và 130,2 (C-olefin); 70,4 (C-2’); 56,0 (CH₃-O); 34,7 (C-3’); 21,4-30,9 (C-metilen); 14,4 (C-23’). Ngoài ra, còn thu được một aminoancol (RTtE3.2) mà từ phổ EIS/MS của nó cho pic phân tử là 459 (M⁺)

Qua các phân tích tổng hợp các số liệu phổ của RTtE3 như trên, có thể khẳng định chất RTtE3 là một cerebrozit, chúng tôi đặt tên cho nó là typhotrilozit A, và có thể đây là một chất mới lần đầu tiên phân lập được từ cây Bán hạ ba thùy. Công thức cấu tạo của hợp chất này có dạng sau.

Do thời gian và khối lượng mẫu thực nghiệm còn ít, vì vậy để xác định cấu trúc hóa học hoàn thiện của cerebrozit này cần làm thực nghiệm với khối lượng mẫu nhiều hơn (khoảng 4-5kg) để thu được khối lượng chất RTtE3 đủ cho làm các thực nghiệm hóa lý (đo thêm các loại phổ như NMR, HR-FAB/MS và các loại phổ khác ..., tiến hành thực hiện các phản ứng hóa học như acyl hóa, thủy phân giáng vị để thu được các thành phần xây dựng lên phân tử RTtE3 như phần đường, phần genin gồm nhánh aminoancol và nhánh axit béo) nhằm thu thập các thông tin đầy đủ và cần thiết cho việc nhận dạng  hợp chất typhotrilozit A.  

[1] Đề tài là luận văn Thạc sỹ của tác giả thực hiện từ 2007-2008 tại Viện khoa học và công nghệ Việt Nam.