Bài viết là công trình nghiên cứu của Tiến sĩ, Bác sĩ Lê Thị Ánh Hồng¹ và các cộng sự Monique Lejay-Collin², Laetitia Berland², Hoàng Thủy Long¹, Nguyễn Thị Vinh³, Francine Grimont², Francois-Xavier Weill² và Maurice R. Scavizzi⁴ (1-Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội; 2-Trung tâm chuẩn thức quốc gia về Salmonella, Viện Pasteur Paris, Pháp; 3-Trường Đại học Y khoa, Hà Nội; 4- Khoa Y, Trường Đại học Paris XIII, Pháp) được PGS.TS Hoàng Hà (Đại học Y Dược Thái Nguyên) biên dịch.

Tóm tắt

610 chủng Salmonella enterica serovar typhi (S. typhi) đã phân lập được từ các bệnh nhân sốt thương hàn thuộc ba miền Bắc -Trung - Nam của Việt Nam từ 1995 đến 2004. Trong 495 chủng S. typhi kháng đa kháng sinh có 233 chủng đã được lựa chọn để nghiên cứu định type và so sánh cấu trúc sinh học phân tử . Có 91 chủng kháng kháng sinh axit nalidixic (Na) và giảm tính nhạy cảm với nhóm kháng sinh fluoquinolon đã được xác định cơ chế đề kháng bằng kỹ thuật PCR và xác định trình tự axit nucleotit. Kết quả cho thấy: các chủng S. typhi đa kháng có chứa từ một đến hai plasmit tự truyền, có trọng lượng phân tử 122 MDa và 63 MDa, các gen mã hóa sự kháng đa kháng sinh nằm trên plasmit 122 MDa, tần suất truyền 10–8 đến 10–5 , lysotype E1 và E3 chiếm đa số, 87% chủng thuộc Ribotype 3a, khẳng định rằng các chủng có cùng một cấu trúc phân tử ADN (cùng một dòng - clone). Chủng kháng Na đều có một điểm đột biến trên gyrA, Ser 83→ Phe (n=87), Ser 83→ Tyr (n=3) and Asp 87→ Gly (n=1).

I. Đặt vấn đề

Trước năm 1993, các chủng S. typhi ở Việt Nam vẫn còn khá nhạy cảm với các kháng sinh thông thường như: chloramphenicol(Cm), ampicillin(Ap), tertacyclin(Te), cotrimoxazol(Ts). Năm 1993 ở miền Nam (Kiên Giang) xảy ra vụ dịch thương hàn do chủng S. typhi kháng đa kháng sinh gây nên: kháng Cm 90%, kháng Ap 93%, kháng Te 100% [1]. Từ năm 1994 đến năm 1996 bệnh thương hàn xuất hiện ở khắp các tỉnh thành của miền Bắc, mà căn nguyên xác định được cũng là do những chủng S. typhi kháng đa kháng sinh: kháng Cm 87%, kháng Ap 80%, kháng Ts 83,1%, trong đó số chủng kháng đa kháng sinh (CmApTs) chiếm 83,3%. Các chủng này có cùng chung một nguồn gốc không? Để trả lời các câu hỏi trên, chúng tôi đã thu thập các chủng S. typhi phân lập được ở 28 tỉnh và thành phố khác nhau thuộc cả ba miền Bắc, Trung, Nam trong giai đoạn 1995 - 2004 để tiến hành nghiên cứu về plasmit, lysotype, cấu trúc ADN nhằm xác định mối liên quan dịch tễ học giữa các chủng ở mức độ phân tử và tìm hiểu cơ chế đề kháng kháng sinh của chúng.

II. Vật liệu và phương pháp

2.1. Vật liệu

Chủng hoang dại:

Tổng số 610 chủng S. typhi được thu thập từ ba miền của Việt Nam giai đoạn 1995 - 2004, 495 chủng đa kháng, kháng 5 loại kháng sinh Ap, Cm, Te, trimethoprim (Tr) và sulfamethoxazol (Su): 194 chủng miền Bắc, 116 chủng miền Trung và 116 chủng miền Nam, chiếm 78,7% các chủng thu thập giai đoạn 1995-1997 và 89,9 % các chủng thu thập giai đoạn 1998 - 2004. 67 chủng kháng 5 loại kháng sinh trên và kháng Na, đồng thời giảm tính nhạy cảm với các Flu khác, 24 chủng kháng Na đơn độc, đồng thời giảm tính nhạy cảm với các Flu khác, thu thập từ 1998 đến 2004 (11 chủng miền Bắc, 10 chủng miền Trung và 70 chủng miền Nam). Các chủng này đã được xác định tính chất sinh vật hoá học, định type huyết thanh và kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh bằng sinh phẩm và khoanh giấy kháng sinh của hãng Bio-Rad trước khi đưa vào nghiên cứu.

Chủng chuẩn: Escherichia coli R39, Escherichia coli K12 J5-3 lactose(+), kháng rifampicin (Rir). Escherichia coli W3110 lactose (+), kháng axit nalidixic (Nar). Citrobacter koseri CIP105177 được cắt với enzym giới hạn MluI cho 12 đoạn ADN có trọng lượng phân tử (kilobase-Kb): 16,8 - 12,5 - 7,3 - 6,6 - 5,8 - 5,1 - 4,4 - 3,0 - 2,8 - 1,7 - 1,4 và 1,2 Kb. 104 loại bacteriophage

Mẫu ADN chuẩn: 

ADN bacteriophage l, 322/Hae III (Raoul) có chứa 22 đoạn ADN có trọng lượng phân tử từ 48,5 Kb đến 0,2 Kb, 1 Kb ADN Ladder, Marker XV

Enzym giới hạn: Hind III, EcoRI, Kpn I, Sca I, Bgl II, Mlu I.

Môi trường:Mueller – Hinton agar, Drigalski lactose và các loại khoanh giấy kháng sinh được cung cấp bởi hãng Bio- Rad, Pháp.

2.2. Phương pháp

Tiếp hợp

142 chủng S. typhi đa kháng của cả ba miền đã được lựa chọn và cho tiếp hợp với chủng nhận là E. coli J5-3 hoặc E. coli W3110 trong điều kiện: tiếp xúc trên bề mặt của môi trường đặc ở 37^oC/5h, sau đó các thể tiếp hợp sẽ được lựa chọn trên môi trường chọn lọc Drigalski có chứa các kháng sinh.Tần suất truyền được tính: tổng số khuẩn lạc thể tiếp hợp / tổng số vi khuẩn cho.

Tách chiết và xác định trọng lượng phân tử của các plasmit

107 chủng S. typhi đa kháng được lựa chọn và các thể tiếp hợp của nó đã được tách chiết plasmit. Các ADN tách được sẽ đưa vào chạy điện di trên gel agarose 0,7% cùng với chủng chuẩn E. coli có chứa 4 plasmit đã biết trọng lượng phân tử. Sau đó các plasmit sẽ được các enzym giới hạn: Kpn I, Sca I, Bgl II cắt để xác định trọng lượng phân tử dựa trên các mẫu ADN chuẩn: PBR 322/Hae III, 1 Kb ADN Ladder, Marker XV và được tính toán bởi 3 chương trình phần mềm: Local fit, Spline, Schaffer và Sederoef .

Xác định lysotype:

155 chủng S. typhi đa kháng và 20 chủng S. typhi nhạy cảm được lựa chọn từ cả ba miền, đã được phân tích bằng 104 bacteriophage theo phương pháp của Guinnee và Van Neuween. Xác định lysotype chỉ thực hiện được ở các chủng có kháng nguyên vỏ (Vi).

Xác định ribotype

155 chủng S. typhi đa kháng và 20 chủng S. typhi nhạy cảm đã được tách chiết ADN và được cắt bởi enzym giới hạn Pst I, sau đó điện di trên gel agarose, tiếp đó mở vòng xoắn của các chuỗi ADN và chuyển chúng sang màng nylon, cho lai ghép với 5 đoạn mồi tổng hợp có chứa từ 18-23 axit nucleotit, tương đương với đoạn gen mã hoá các rARN 16S, 23S và được đánh dấu bởi chất Digoxigen.

Xác định cơ chế kháng kháng sinh fluoroquinolone:

91 chủng S. typhi kháng Na, giảm tính nhạy cảm với nhóm Flu và 2 chủng nhạy cảm với Na (chủng chứng) đã được phân tích bằng kỹ thuật PCR để nhân đoạn ADN chứa các gen mã hoá tạo enzym ADN-gyrase của chủng vi khuẩn, được gọi là gyrA. Trình tự của các axit nucleotit của đoạn mồi được sử dụng trong kỹ thuật này là: 5’-TGTCCGAGATGGCCTGAAGC-3’ (STGYRA1) và 5’-CGTTGATGACTTCCGTCAG-3’ (STGYRA12), được mô tả bởi Baucheron và cộng sự . Sau khi đã được nhân lên, các đoạn ADN này được giải trình tự các axit nucleotit trên cả hai máy tự động chuẩn Genome Express (Meylan, France), và ABI 100 DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster,Calif. USA). Xác định điểm đột biến bằng chương trình phần mềm Lasergene (Dnastar, Madison, Wis.).

III. Kết quả

Kiểu cách đề kháng và tần suất truyền của các plasmit chứa gen mã hóa sự kháng kháng sinh (R-plasmit): 100% chủng S. typhi của miền Bắc và miền Trung có R-plasmit tự truyền, 90% số chủng ở miền Nam có R-plasmit tự truyền, tần suất truyền từ 10-8 đến 10-5. Hầu hết các gen mã hóa sự kháng đa kháng sinh (CmApTeTrSu) đều nằm trên R-plasmit tự truyền.

Tách chiết và xác định trọng lượng phân tử của các plasmit:

Có 32/36 chủng S. typhi của miền Bắc có chứa một plasmit lớn 122 MDa, có 27/34 chủng S. typhi của miền Trung có chứa hai plasmit 122MDa và 63MDa, có 24/37 chủng S. typhi của miền Nam có chứa hai plasmit 122 MDa và 63 MDa. Cả hai plasmit này đều có thể được truyền sang chủng nhận E. coli K12-j5-3. Trong hai plasmit trên, plasmit lớn 122 MDa chứa toàn bộ các gen mã hóa sự kháng đa kháng sinh, vì ở cả những chủng S. typhi và E. coli thể tiếp hợp chỉ chứa một plasmit lớn 122 MDa nhưng vẫn thể hiện kiểu cách đề kháng là CmApTeTrSu. (Xem ảnh 2).

So sánh cấu trúc phân tử của các plasmit chứa gen mã hóa sự kháng đa kháng sinh

61 E. coli thể tiếp hợp có chứa một plasmit lớn 122 MDa: 28 miền Bắc, 14 miền Trung, 19 miền Nam, đã được tách chiết plasmit ADN, sau đó được tinh khiết và được cắt hai lần đồng thời bởi hai enzym giới hạn Hind III và EcoR I, để tìm hiểu về cấu trúc phân tử. Kết quả cho thấy các plasmit này sau khi được cắt 2 lần bởi 2 enzym giới hạn khác nhau (cắt ở 2 điểm khác nhau), cả 2 lần cắt đều tạo ra các đoạn ADN có cùng trọng lượng phân tử (trên gel agarose chúng có khoảng cách điện di bằng nhau), điều này cho ta giả thiết rằng các plasmit ADN này có cấu trúc phân tử giống nhau (xem ảnh 4). Như vậy các plasmit ADN này có cùng một nguồn gốc.

Xác định lysotype:

Lysotype E1 và E3 chiếm ưu thế trong các chủng S. typhi kháng đa kháng sinh: 95/131 chủng thuộc một trong 2 lysotype này, chiếm tỷ lệ 72,5%. Các chủng S. typhi miền Bắc thuộc lysotype E1, có 4 chủng thuộc lysotype E3; Các chủng S. typhi miền Trung thuộc lysotype E3, chỉ có một chủng lysotype E1; Các chủng S. typhi miền Nam có cả lysotype E1 và E3 với tỷ lệ tương đương nhau (xem bảng kết quả). 

Xác định ribotype:

155 chủng S. typhi đa kháng kháng sinh đã được xác định ribotype (xem ảnh 3 và bảng kết quả). Trong đó có 135/155 chủng thuộc ribotype 3a đồng thời mang lysotype E1 hoặc E3 chiếm tỷ lệ 87%. Số chủng còn lại thuộc một trong các type khác: 230, n2 hoặc 3a1, S007, S142, 177, 73/34/8, S123, những chủng này cũng mang một trong hai lysotype E1 hoặc E3. Tất cả các chủng không có kháng nguyên vỏ (Vi) đều thuộc ribotype 3a.

Bảng kết quả xác định lysotype và ribotype của các chủng S.typhi

Xác định cơ chế kháng fluoroquinolon

91 chủng kháng Na và giảm tính nhạy cảm với Flu chỉ có một điểm đột biến trên gyrA: ở vị trí Ser-83 có 87 chủng đột biến đổi thành Phe-83, 3 chủng đột biến đổi thành Tyr-83 và ở vị trí Asp-87 có 1 chủng đột biến đổi thành Gly-87. Có 2 chủng S. typhi nhạy cảm hoàn toàn với các loại kháng sinh được tiến hành song song để đối chứng và cả hai chủng này đều không thấy có sự đột biến trên.

IV. Bàn luận

Sau vụ dịch thương hàn do S. typhi kháng đa kháng sinh mang plasmit tự truyền có kích thước lớn phân lập được ở Mexico năm 1972, có nhiều vụ dịch thương hàn xẩy ra ở các nước đang phát triển như: Nam Mỹ, Kuwait, Châu phi [2], Đông nam châu á [3, 4]. Hầu hết đều có chứa plasmit có trọng lượng phân tử từ 110 đến 290 kb, kích cỡ này có thể thay đổi ở từng vụ dịch hoặc từng nước khác nhau, song chúng tồn tại và bền vững trong suốt thời kỳ có dịch, đặc biệt là đều có kích cỡ khá lớn. Gần đây, các chủng S. typhi phân lập được ở miền Nam Việt Nam từ 1993 đến 1997 có chứa plasmit có trọng lượng phân tử 215 kb » 140 MDa [5].

Ribotype 3a chiếm một tỷ lệ đáng kể 87% trong tổng số các chủng S. typhi kháng đa kháng sinh, điều này nói lên rằng những chủng này có sự đồng nhất về cấu trúc ADN. Như vậy là chỉ có duy nhất một dòng (clone) vi khuẩn xuất hiện ở các vụ dịch sốt thương hàn do S. typhi kháng đa kháng sinh phân lập ở cả ba miền từ miền Nam, đến miền Trung và miền Bắc, trong giai đoạn 1995 - 2004.

Những nghiên cứu gần đây của Grimont F. và Grimont P.A.D. cho thấy hầu hết các chủng S. typhi phân lập được ở khu vực Châu Á (Ấn Độ, Pakistan, Lào…) thuộc ribotype 3a và lysotype E1, chưa thấy lysotype E3. Trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi có 51 chủng 3a - E1, giống như những chủng đang lưu hành trong khu vực Châu Á, nhưng lại có 33 chủng 3a - E3 là lysotype chưa thấy lưu hành ở các nước Châu Á, vậy phải chăng các chủng S. typhi phân lập được ở Việt Nam đã có sự biến đổi cấu trúc kháng nguyên vỏ (Vi) ở một số chủng miền Nam và hầu hết các chủng ở miền Bắc, bởi chúng mang lysotype E3?

V. Kết luận

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi hy vọng sẽ đem lại những hiểu biết mới về dịch tễ học phân tử các chủng S. typhi đa kháng kháng sinh là căn nguyên gây ra các vụ dịch sốt thương hàn ở Việt Nam trong gần thập kỷ qua, giúp các nhà dịch tễ học xây dựng các chiến lược phòng chống sự lây lan của chúng trong cộng đồng, đặc biệt lưu ý hạn chế các nguồn lây nhiễm từ thực phẩm và nguồn nước. Những hiểu biết về cơ chế kháng kháng sinh của các chủng S. typhi cũng sẽ đóng góp tích cực cho công tác điều trị. Hiện nay, để có hiệu quả cao nhất trong điều trị bệnh thương hàn, cần thiết phải tuân theo kết quả kháng sinh đồ. Kháng sinh thế hệ mới fluoroquinolon không phải lúc nào cũng cho hiệu quả cao, trong khi đã có những chủng S. typhi trở nên nhạy cảm với các kháng sinh thông dụng.

Tài liệu tham khảo

1. Phạm Kim Sắc và cộng sự. (1995). Về vụ dịch thương hàn tại huyện An Minh, tỉnh Kiên Giang. Tạp chí vệ sinh phòng dịch, tập 2, số 4 (23): 104-106.

2. Adeleye IA, Adetosoye AI. (1993). Antimicrobial resistance patterns and plasmit survey of Salmonella and Shigella isolated in Ibadan, Nigeria. East. Afr. Med. J. 70(5): 259-62.

3. Albert MJ, Haider K, Nahar S, Kibriya AK, Hossain MA. Multiresistant Salmonella typhi in Bangladesh. J. (1991). Antimicrob Chemother. 27(4): 554-5.

4. Altwegg M., Hickman-Brenner F.W., Farmer J.J. 3rd. (1989). Ribosomal RNA gene restriction patterns provide increased sensitivity for typing Salmonella typhi strains. J. Infect. Dis.160(1):145-9.

5. Connerton P., Wain J., Hien T.T., Ali T., Parry C., Chinh N.T., Vinh H., Ho V.A., Diep T.S., Day N.P., White N.J., Dougan G.Farrar J.J. (2000). Epidemic typhoid in vietnam: molecular typing of multiple-antibiotic-resistant Salmonella enterica serotype typhi from four outbreaks. J. Clin. Microbiol. 38(2): 895-7.

6. Grimont F., Grimont P.A. (1990). La carte d’identite genetique des bacteries. In: Biofutur – Novembre 1990: 50-52.

Doctor SAMAN

Tác giả: Tiến sĩ, Bác sĩ Lê Thị Ánh Hồng và các cộng sự Monique Lejay-Collin, Laetitia Berland, Hoàng Thủy Long, Nguyễn Thị Vinh, Francine Grimont, Francois-Xavier Weill và Maurice R. Scavizzi

Người biên dịch: PGS.TS Hoàng Hà