1. MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới có khí hậu phổ biến là nóng và ẩm. Đây được xem là điều kiện thuận lợi để nấm mốc phát triển trên nông sản thực phẩm. Và một trong những vấn đề thường gặp nhất với nấm mốc trên thực phẩm là một số trong số chúng có thể tạo ra aflatoxin - một loại độc tố nguy hiểm cho sức khỏe của con người và động vật. Aflatoxin thường nhiễm vào những loại thực phẩm như ngũ cốc (gạo, ngô,…), hạt có dầu (đậu tương, lạc,…), gia vị (hạt tiêu đen, nghệ,…), các loại quả, hạt khác (hạt dẻ, dừa,…) và trong sữa của động vật khi ăn phải thức ăn nhiễm Aflatoxin  [17]. Nguy cơ hiện diện của chúng trên nhiều mặt hàng nông sản, thực phẩm có thể gây ảnh hưởng lớn về độ an toàn đối với ngành công nghiệp thực phẩm. Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) đã phân loại aflatoxin là chất gây ung thư ở người loại I. Vì vậy nồng độ của Aflatoxin trở thành một trong những chỉ số quan trọng nhất về độc tính của nó. Con người tiếp xúc với aflatoxin trực tiếp từ việc tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm hoặc gián tiếp từ thực phẩm có nguồn gốc từ động vật trước đây tiếp xúc với aflatoxin trong thức ăn có thể sẽ gây ra ngộ độc cấp tính hoặc mãn tính nguy hại kéo dài [11]. Do đó, sử dụng phương pháp phát hiện và giải độc Aflatoxin được coi là một giải pháp quan trọng để hạn chế được sự nguy hiểm của chúng. Bài viết này sẽ tập trung cập nhật các tính chất, độc tính, cơ chế tác động của Aflatoxin cùng với những phương pháp hiện và giải độc Aflatoxin phù hợp, hiệu quả nhất để đảm bảo chất lượng, dinh dưỡng của thực phẩm và an toàn với con người và động vật.

2. CẤU TRÚC VÀ CÁC TÍNH CHẤT CỦA AFLATOXIN                                       

2.1. Cấu trúc hóa học.

Hiện nay, đã phát hiện khoảng gần 20 loại aflatoxin khác nhau. Tuy nhiên có 4 loại chính thường gặp nhất: Aflatoxin B1 (AFB1), Aflatoxin B2 (AFB2), Aflatoxin G1 (AFG1), Aflatoxin G2 (AFG2)  và được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng như B (Blue: xanh nước biển), G (Green: xanh lá cây). AFB1 & AFB2 được sản xuất bởi Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. AFG1 &AFG2 được sản xuất bởi Aspergillus parasiticus. AFB1, AFB2 trong sữa bò được chuyển hóa và gọi là Aflatoxin M1 (AFM1) và Aflatoxin M2 (AFM2). Trong đó AFB1 được đánh giá là có nồng độ cao nhất, gây độc nhất, sau đó là AFG1, AFB2,  AFG2 [17,18].

2.2. Tính chất vật lý.

Aflatoxin tinh khiết không màu hoặc có màu vàng nhạt, phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài tuy nhiên nó không ổn định khi có sự hiện diện của không khí và môi trường có độ phân cực cao. Chúng ít hoặc không bị phá hủy dưới điều kiện nấu bình thường hoặc làm nóng khi thanh trùng. Aflatoxin được hòa tan trong dung môi phân cực nhẹ và ít tan trong nước.

2.3. Tính chất hóa học

Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử Afatoxin

làm chúng nhạy cảm với việc thủy phân trong môi trường kiềm. Tuy nhiên nếu xử lý kiềm là nhẹ thì việc axit hóa sẽ phản ứng ngược trở lại để tạo Aflatoxin ban đầu.

Bảng 1: Tính chất lý - hóa chủ yếu của Aflatoxin

3. ĐỘC TÍNH

Aflatoxin có khả năng gây độc cấp tính và mãn tính ở người và động vật. Aflatoxin có thể làm phá hủy tế bào gan, thận và các bộ phận khác; Ức chế lên hệ miễn dịch, gây đột biến, quái thai; Ăn mòn thành ruột và dạ dày; Suy dinh dưỡng, suy giảm tăng trưởng ở người và động vật. Nghiêm trọng và nguy hiểm nhất là khả năng gây ung thư gan [11]

4. CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG

AFB1 là độc tố mạnh nhất, có liên quan mạnh mẽ đến sự phát triển của ung thư biểu mô tế bào gan (HCC).                            

AFB1 được chuyển hóa bởi enzym cytochrome P450 ở gan thành AFB1-8,9-epoxide (AFB1-E) để tạo thành chất gây ung thư bằng cách phá vỡ quá trình sửa chữa của DNA. AFB1-E xen vào giữa DNA, hình thành sản phẩm cộng hợp AFB1-E-N7-dG do phản ứng với các nguyên tử N7 của guanine. Sự đan xen các epoxit gây ra sự chuyển G thành T ở codon 249 của gen p53 trong gan (AGG -> AGT: Arg -> Ser). Khi gen p53 bị đột biến, nó cho thấy mức tăng của chức năng gây ung thư, có thể gây HCC [7,8,10].

5. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN

5.1. Phát hiện bằng đường lý-hóa học

Việc nhận biết Aflatoxin có thể dựa vào 1 số tính chất của chúng như: Khử nitrat bạc ammoniac, molipdat, natri tungstat; Trong môi trường pecloric, tạo cacbonzon thành hợp chất có màu tím đặc tưng, cũng chức năng này phản ứng yếu với vanilin trong môi trường xút 38%; Ngưng tụ với phenol trong môi trường sunfuric và acid sunfuric cũng có hình vết dẻ quạt; Dễ bị phân hủy trong môi trường kiềm; Phản ứng với di-O-anizidin-tetrazolium clorua để tạo thành các hợp chất xanh - tím với các AFB1, AFB2 và nâu với AFG2.

5.1.1. Phương pháp chiết xuất và tinh chế nước chiết

Dựa trên tính chất của Aflatoxin tan trong

một số dung môi hữu cơ (cloroform, axeton, metanol, etanol,...), không tan trong dung môi béo (hexan, ete dầu hỏa)[16].

5.1.2. Tách bằng sắc ký

Sắc ký là một trong những phương pháp phổ biến nhất để phân tích độc tố nấm mốc như aflatoxin. Bao gồm sắc ký giấy, sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng. Trong đó sắc ký lớp mỏng (TLC) là phương pháp được sử dụng thường xuyên nhất. Phương pháp có thể triển khai trong nhiều hỗn hợp khác nhau như cloroform:metanol (99:1), (98:2),…; cloroform :axeton (90:10), (85:15);…Thời gian thay đổi từ 45 phút hay 2-3 giờ, nên hoạt hóa bằng nhiệt. Sử dụng alumin, bột xenluloza hoặc gel poliamit làm giá. Một điểm quan trọng nữa là các lớp mỏng phải thật bão hòa trước trong bình, nơi sắc ký sẽ triển khai. Ưu điểm của  TLC là nó có thể phát hiện một số loại mycotoxin trong mẫu thử nghiệm, có độ nhạy cao, tuy nhiên đòi hỏi kỹ thuật viên lành nghề, tiền xử lý mẫu và thiết bị đắt tiền, TLC cũng thiếu đi độ chính xác [1].

5.2. Phương pháp định lượng

Việc định lượng và định tính các Aflatoxin có thể thực hiện bằng các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hiệu suất cao, sắc ký lỏng hiệu năng cao và ELISA.

5.2.1. Sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao (HPTLC)

Đây chính là 1 phương pháp cải thiện của TLC. HPTLC có tính thuyết phục cao ở 3 khía cạnh: đưa mẫu lên bản mỏng một cách tự động, cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp phụ, chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát. Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó các vết được định đúng vị trí và đo lường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitometers. Thể tích mẫu được dùng có thể bằng 1µl so với 5-10µl mẫu trong phương pháp TLC, như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích của vết. Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xác định tới 30pg AFB1 ở lạc. HPTLC là một trong những phương pháp hiệu quả và chính xác nhất trong phân tích aflatoxin. Tuy nhiên, yêu cầu người vận hành phải lành nghề, việc thiết bị cồng kềnh, chi phí thiết bị lớn, tiền xử lý mẫu rộng giới hạn HPTLC trong phòng thí nghiệm, khó áp dụng trong tình huống thực địa [1].

5.2.2. Sắc kí lỏng cao áp (HPLC)

Phương pháp này sử dụng hai pha là pha động

và pha tĩnh, dựa trên sự hấp thụ tia Uv và xác định cường độ huỳnh quang. Các chất có bản chất khác nhau sẽ bị tách theo thời gian khác nhau trong cột tách. Mẫu phân tích được tách bằng Chloroform và nước, ly tâm chất tách và làm sạch qua silicagel, pha tĩnh thường sử dụng cột nhồi silicagel 5 micromet và pha động sử dụng bezen:acetonitrit:acid formic. Sau đó aflatoxin được phát hiện nhờ đầu dò huỳnh quang, giới hạn phát hiện thấp tới 0.1ng/kg. Phương pháp này cung cấp kết quả phát hiện nhanh, độ chính xác cao, độ nhạy cao và tự động hóa cao, cột sắc ký có thể sử dụng nhiều lần, thời gian ngắn. Tuy nhiên nó lại yêu cầu tinh chế mẫu nghiêm ngặt bằng các cột miễn dịch [1].

5.2.3. ELISA

ELISA trực tiếp: Dựa trên nguyên lý kháng thể đặc hiệu được phủ trên các đĩa chuẩn độ. Dung dịch tách từ mẫu hay aflatoxin chuẩn được ủ cùng nhau hay tách thành hai bước. Sau đó rửa bằng dung dịch thích hợp. Lượng men gắn vào đĩa được xác định bằng dung dịch đặc biệt. Phản ứng màu được đo bằng quang phổ hoặc so sánh bằng mắt thường với các đĩa tiêu chuẩn. Phương pháp này chiếm thời gian và sai số lớn trong cùng một mẫu phân tích do sự xâm nhập của các chất ngoại lai có trong mẫu tách.

ELISA gián tiếp: Trong phương pháp này aflatoxin gắn vào protein được phủ các đĩa chuẩn độ. Mẫu tách hay aflatoxin chuẩn được đưa vào đĩa, tiếp theo là kháng thể thứ cấp. Lượng kháng thể gắn vào đĩa được xác định do thêm IgG kháng thể gắn với photphataza kiềm và phản ứng màu xảy ra với P-nitrophenyl photphat. Lượng độc tố được xác định bằng cách so sánh với đường độc tố chuẩn. Toàn bộ quá trình chiếm khoảng 5 giờ. So sánh với phương pháp ELISA trực tiếp, phương pháp ELISA gián tiếp trải qua nhiều bước hơn và cần một kháng thể thứ cấp, vì vậy khả năng sai số cao hơn và chiếm nhiều thời gian.

Nhận xét chung về ELISA thì đây là phương

pháp có thể phân tích được đồng thời số lượng mẫu lớn; bộ dụng cụ rẻ, dễ sử dụng và không yêu cầu làm sạch mẫu rộng; không có mối nguy hiểm sức khỏe. Tuy nhiên nó đòi hỏi tốn nhiều công sức và thời gian [1].

6. PHƯƠNG PHÁP KHỬ ĐỘC

6.1. Phương pháp vật lý

6.1.1. Nhiệt độ

Afllatoxin có nhiệt độ phân hủy cao có thể dao động từ 237-306°C. Khi đun nóng ở nhiệt độ 150-200^oC mức AFB1 có thể giảm từ 50-90% [9]. Độ ẩm cũng có thể ảnh hưởng tới khả năng phân hủy của Aflatoxin ví dụ như khô lạc chứa 0.144mg/kg AFB1, khi nâng nhiệt lên 100^oC trong 2.5 giờ, nếu hàm lượng nước là 6.6% thì không có tác dụng nhưng nếu hàm lượng nước là 15-30% thì lượng Aflatoxin giảm đi còn ¼ lượng ban đầu. Phương pháp sử dụng nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến chất lượng, tuổi thọ của sản phẩm hoặc sản phẩm có thể bị tái nhiễm.

6.1.2. Chiếu xạ

Việc khử độc tố Aflatoxin còn có thể dựa vào việc sử dụng tia gamma có sóng điện từ xuyên thấu mạnh có thể xuyên qua vật liệu mà không để lại bất kỳ dư lượng nào, đó là lợi thế của nó. Với liều phóng xạ 10 KGy, sự phát triển của nấm mốc bị ức chế hoàn toàn. Liều 15, 20, 25 và 30 KGy là đủ để phá hủy aflatoxin B1 khoảng 55-74% [6].

6.2. Phương pháp hóa học

6.2.1. Axit hóa

Axit là một phần tự nhiên của thực phẩm, nó được thêm vào công nghiệp để thêm hương vị cho thực phẩm và thậm chí một số axit được sử dụng làm chất bảo quản hoặc chất chống oxy hóa. Thực hiện phương pháp axit hóa thực phẩm bị ô nhiễm bởi AFB1 đã chứng minh hiệu quả cao khi sử dụng axit citric, lactic, tartaric và clohydric. Tỷ lệ giảm của AFB1 trong axit citric 1,0 N, axit lactic, axit succinic và axit tartaric trong 18 giờ lần lượt là 94,1%, 92,7%, 62,0% và 95,1% [12]. Trong 1 nghiên cứu khác trong vòng 20 phút ở nhiệt độ phòng và khi đun sôi, axit citric 1M cũng đem tới kết quả rất tốt khi chuyển đổi  97%- 98% AFB1 thành AFB2a (ít độc hại hơn rất nhiều so với AFB1) [15].

6.2.2 Amoni hóa

Ammonization được sử dụng để phá vỡ AFB1 trong môi trường kiềm. Trong thí nghiệm khử  aflatoxin ở ngô bằng khí amoniac ở áp suất khí quyển đã cho thấy mức giảm từ 1000 ppb xuống 20 ppb [5].

6.2.3. Ozon hóa

Ozone hóa có hiệu quả trong việc kiểm soát tổng số nấm và giảm nồng độ độc tố của hầu hết các aflatoxin trong điều kiện tối ưu hóa. Aflatoxin trong đậu phộng ở độ ẩm 5%  rất nhạy cảm với ozone và dễ bị phân hủy khi phản ứng với 6.0 mg/l ozone trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tỷ lệ giải độc của tổng aflatoxin và AFB1 lần lượt là 65,8% và 65,9%. Ngoài ra, nó còn được đánh giá cao bởi dinh dưỡng và chất lượng của nông sản được xử lý không thay đổi đáng kể hay không cho thấy bất kỳ tác dụng độc hại nào đối với động vật trong quá trình thực hiện [2,3,4].

6.3. Phương pháp sinh học

 6.3.1 Sinh vật

Việc can thiệp của các chủng vi khuẩn hoặc nấm là 1 tiềm năng trong giảm thiểu AFB1. Thời gian thực hiện của phương pháp này thường dài nhưng lượng độc tố mất đi tương đối cao. Điển hình như vi khuẩn axit lactic được khuyến khích sử dụng như một chất khử độc sinh học cho aflatoxin [14].

6.3.2. Chiết xuất

Chiết xuất từ ​​lá A.vasica (Adhatoda vasica Nees) cho thấy sự giải độc AFB1 lớn nhất (≥ 98%) sau khi ủ trong 24 giờ ở 37 °C. Hoạt tính giải độc aflatoxin của chiết xuất lá A.vasica đã giảm đáng kể bằng cách làm nóng đến 100°C trong 10 phút hoặc hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút [18].

6.3.3. Enzym

Cuối cùng, việc sử dụng các enzyme tinh khiết từ các nguồn sinh học khác nhau như laccase, mangan peroxidase và enzyme phân hủy Bacillus aflatoxin cũng đem lại hiệu quả suy giảm AFB1 cao [13,19].

7. KẾT LUẬN

Bằng chứng nghiên cứu từ những năm về trước đã cho thấy những tác động tiêu cực của Aflatoxin trên nông sản thực phẩm và sức khỏe con người. Vì vậy mà ngay cả  trước và sau thu hoạch các nông sản thực phẩm cũng đều cần có sẵn các lựa chọn phù hợp để giảm việc lây nhiễm Aflatoxin vào cơ thể con người. Sàng lọc các nguyên liệu đổi màu, hư hỏng và thực hiện điều kiện bảo quản thích hợp (nhiệt độ, độ ẩm, thông gió,...) cũng là một số bước quan trọng để hạn chế sự lây lan của aflatoxin. Tùy thuộc vào hoàn cảnh, điều kiện để lựa chọn sử dụng các phương pháp vật lý, hóa học, sinh học cho việc giải độc Aflatoxin được phù hợp, cần xem xét cẩn trọng để đưa đến được điều kiện tối ưu nhất, giảm xuống mức thấp nhất có thể lượng Aflatoxin, không ảnh hưởng lớn đến giá trị dinh dưỡng thực phẩm hay không để xảy ra việc dư lượng các hóa chất gây biến chứng sau này cho con người.

8. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Alex P. Wacoo, Deborah Wendiro,Peter C. Vuzi and Joseph F. Hawumban, 2014. Methods for Detection of Aflatoxins in Agricultural Food Crops. Journal of Applied Chemistry. 1-15.

2. Chen, R., Ma, F., Li, P.W., Zhang, W., Ding, X.X., Zhang, Q., Li, M., Wang, Y.R., Xu, B.C., 2014. Effect of ozone on aflatoxins detoxification and nutritional quality of peanuts. Food Chem. 146, 284-288.

3. de Alencar, E.R., Faroni, L.R.D.A., Soares, N., de, F.F., da Silva, W.A., da Silva Carvalho, M.C., 2012. Efficacy of ozone as a fungicidal and detoxifying agent of aflatoxins in peanuts. J. Sci. Food Agric. 92 (4), 899-905.

4. Diao, E., Hou, H., Chen, B., Shan, C., Dong, H., 2013. Ozonolysis efficiency and safety evaluation of aflatoxin B 1 in peanuts. Food Chem. Toxicol. 55, 519-525.

5. Bagley, E.B., 1979. Decontamination of corn containing aflatoxin by treatment with ammonia. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 56 (9), 808-811.

6. Ghanem, I., Orfi, M., Shamma, M., 2008. Effect of gamma radiation on the inactivation of aflatoxin B1 in food and feed crops. Braz J Microbiol. 39 (4), 787–791.

7. Guengerich, F.P., Johnson, W.W., Ueng, Y.F., Yamazaki, H., Shimada, T., 1996. Involvement of cytochrome P450, glutathione S-transferase, and epoxide hydrolase in the metabolism of aflatoxin B1 and relevance to risk of human liver cancer.

Environ. Health Perspect. 104 (l), 557-562.

8. Hamid A.S., Tesfamariam I.G, Zhang Y., Zhang Z.G., 2013 .Aflatoxin B1-induced hepatocellular carcinoma in developing countries: Geographical distribution, mechanism of action and prevention. Oncol Lett. 5(4), 1087-1092.

9. Hwang, J.H., Lee, K.G., 2006. Reduction of aflatoxin B1 contamination in wheat by various cooking treatments. Food Chem. 98 (1), 71-75.

10. Johnson, W.W., Guengerich, F.P., 1997. Reaction of aflatoxin B1 exo-8,9-epoxide with DNA: kinetic analysis of covalent binding and DNA-induced hydrolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 94 (12), 6121-6125.

11. Jonathan H. Williams, Timothy D. Phillips, Pauline E. Jolly, Jonathan K. Stiles, Curtis M. Jolly, Deepak Aggarwal, 2004. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. The American Journal of Clinical Nutrition. 80 (5), 1106-1122. 

12. Lee, J., Her, J.Y., Lee, K.G., 2015. Reduction of aflatoxins (B1, B2, G1, and G2) in soybean-based model systems. Food Chem. 189, 45-51.

13. Loi, M., Fanelli, F., Zucca, P., Liuzzi, V., Quintieri, L., Cimmarusti, M., Monaci, L., Haidukowski, M., Logrieco, A., Sanjust, E., Mule, G., 2016. Aflatoxin B1 and M1 degradation by Lac2 from Pleurotus pulmonarius and redox mediators. Toxins (Basel). 8 (9), 245.

14.Oluwafemi,F.,Kumar,M.,Bandyopadhyay,R., Ogunbanwo, T., Ayanwande, K.B., 2010. Bio-detoxification of aflatoxin B1 in artificially contaminated maize grains using lactic acid bacteria. Toxin Rev. 29 (3-4), 115-122.

15. Rushing, B.R., Selim, M.I., 2016. Effect of dietary acids on the formation of aflatoxin B2a as a means to detoxify aflatoxin B1. Food Addit. Contam. Part A Chem. Anal. Control. Expo. Risk Assess. 33 (9), 1456-1467.

16. Bertuzzi, T., Rastelli, S., Mulazzi, A., Pietri. A., 2012. Evaluation and improvement of extraction methods for the analysis of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 from naturally contaminated maize. Food Analytical Methods.  5 (3),  512.

17. Usha P. Sarma, Preetida J. Bhetaria, Prameela Devi and Anupam Varma, 2017. Aflatoxins: Implications on Health. Indian J Clin Biochem. 32(2), 124-133.

18. Vijayanandraj, S., Brinda, R., Kannan, K., Adhithya, R., Vinothini, S., Senthil, K., Chinta, R.R., Paranidharan, V., Velazhahan, R., 2014.

Detoxification of aflatoxin B1 by an aqueous extract from leaves of Adhatoda vasica Nees. Microbiol Res. 169 (4), 294-300.

19. Xu, L., Ahmed, M.F.E., Sangare, L., Zhao, Y., Selvaraj, J.N., Xing, F., Wang, Y., Yang, H., Liu, Y., 2017. Novel aflatoxin-degrading enzyme from bacillus shackletonii L7. Toxins (Basel). 9 (36).

Doctor SAMAN
Kỹ sư Thực phẩm Nông Việt Trinh